Minh Tông đại vương kế vị khi chỉ 12 tuổi, còn ít tuổi chưa đủ sức để gánh vác việc triều đình. Theo thông lệ, Đại vương Đại phi Doãn thị có thể Thùy liêm thính chánh (垂簾聽政)[1]. Trong thời gian làm nhiếp chính, bà đã dùng em là Doãn Nguyên Hành làm phụ chính, thực sự chuyên quyền trong một thời gian dài, từ năm 1545 đến năm 1565, tổng cộng 20 năm nắm đại quyền.

Khi vừa ổn định, Doãn Nguyên Hành và Trịnh Thuận Bằng (鄭順朋) bè đảng vu cáo Doãn Nhậm và Liễu Quán (柳灌) cùng các sĩ lâm có ý mưu phản. Cuối cùng, Doãn Nhậm và các người theo phe đều bị xử tử, Đại Doãn phái hoàn toàn bị lật đổ. Sử gọi là Ất Tị sĩ họa (乙巳士禍). Năm 1547, Minh Tông dâng cho bà tôn hiệu là Thánh Liệt đại vương đại phi (聖烈大王大妃). Tháng 9 năm ấy lại tôn thêm 2 chữ Nhân Minh (仁明), gọi đầy đủ là Thánh Liệt Nhân Minh đại vương đại phi (聖烈仁明大王大妃).

Năm 1553, Minh Tông đại vương thân chính, trọng dụng cửu phụ của Vương phi Thẩm thị là Lý Lương (李樑), dần dần giảm đi thế lực trong triều của ngoại thích họ Doãn. Tuy vậy, Đại vương đại phi vẫn giữ đại quyền, hằng ngày minh Tông đều phải vấn an Đại phi và trình bản duyệt cho Đại phi xem xét.

Trong thời gian làm nhiếp chính bà đã phục hồi nền Phật giáo ở Triều Tiên với sự giúp đỡ rất nhiều của Trịnh Lan Trinh (鄭蘭貞, Jeong Nan jeong), dỡ bỏ các lệnh cấm, cho xây dựng các chùa đền thờ phật. Bà còn cho mời một vị đại sư vào cung để tham vấn việc nước cùng bà, việc này làm tầng lớp sĩ phu Nho giáo rất tức giận. Bên cạnh đó, bà còn phá lệ cho phép một tiểu thiếp được trở thành Chính thất, điều này gần như là không thể trong xã hội thời đó. Bà đã sắc phong cho Trịnh Lan Trinh làm Chính nhất phẩm Trinh Kính phu nhân (貞敬夫人).

Năm 1565, ngày 29 tháng 12, Đại vương đại phi Doãn thị thăng hà tại Chiêu Đức đường trong Xương Đức cung, hưởng thọ 65 tuổi, an táng tại Thái lăng (泰陵), bên cạnh Trung Tông đại vương. Thụy hiệu của bà là Thánh Liệt Nhân Minh Văn Định Vương hậu (聖烈仁明文定王后).